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細胞凋亡晚期檢測技術
發布時間:2019/11/14 9:06:39 閱讀次數:27

     晚期檢測:

 
    細胞凋亡晚期中,核酸內切酶(某些Caspase的底物)在核小體之間剪切核DNA,產生大量長度在180-200 bp 。對于這一現象的檢測通常有以下兩種方法:
 
    1.TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end-labeling)
 
    通過DNA末端轉移酶將帶標記的 dNTP (多為dUTP)間接或直接接到3’-OH端,再通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。美國Intergen公司提供多種標記方法,直接熒光標記,介導熒光標記或過氧化物酶聯顯色,可做細胞懸液、福爾馬林固定或石蠟處理的組織、細胞培養物等多種樣本的檢測。其中,直接標記步驟少,操作簡便。而間接標記有信號放大的作用,檢測靈敏度高。
 
    2.LM-PCR Ladder (連接介導的PCR檢測)
 
    當凋亡細胞比例較小以及檢測樣品量很少(如活體組織切片)時,直接瓊脂糖電泳可能觀察不到核DNA的變化。CLONTECH公司的ApoAlert?LM-PCR Ladder Assay Kit通過LM-PCR(ligation-mediated PCR),連上特異性接頭,專一性地擴增核小體的梯度片段,從而靈敏地檢測凋亡時產生的核小體的梯度片段。此外,LM-PCR 檢測是半定量的,因此相同凋亡程度的不同樣品可進行比較。
 
    上述兩種方法都針對細胞凋亡晚期核DNA斷裂這一特征,但細胞受到其它損傷(如機械損傷,紫外線等)也會產生這一現象,因此它對細胞凋亡的檢測會受到其它原因的干擾。
 
    3.emerase Detection (端粒酶檢測)
 
    這是相對來說推出較早,用得較多的一種方法。端粒酶是由RNA和蛋白組成的核蛋白,它可以自身RNA為模板逆轉錄合成端粒區重復序列,使細胞獲得“永生化"。正常體細胞是沒有端粒酶活性的,每分裂一次,染色體的端粒會縮短,這可能作為有絲分裂的一種時鐘,表明細胞年齡、復制衰老或細胞凋亡的信號。研究發現,90%以上的癌細胞或凋亡細胞都具有端粒酶的活性。Intergen公司的TRAP-eze emerase Detection Kit在1996年推出。它提供特定的寡核苷酸底物,分別與底物及端粒重復序列配對的引物。如果待測樣本中含有端粒酶活性,就能在底物上接上不同個數的6堿基(GGTTAG)端粒重復序列,通過PCR反應,產物電泳檢測就可觀察到相差六個堿基的DNA Ladder現象(參見圖4)。此外,Intergen公司還提供用酶聯免疫法(ELISA)檢測的試劑盒.
 
    同樣,這種檢測方法也不專對細胞凋亡,檢測結果也不純反應細胞凋亡的發生。
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